Olympus FV-1000 konfokális mikroszkóppal egybeépített fluoreszcencia korrelációs spektroszkóp

Olympus FluoView 1000 konfokális lézerpásztázó mikroszkóp és fluoreszcencia korrelációs spektroszkóp

Elhelyezés: 4032 Debrecen, DE OEC Molekuláris Medicina Kutató Központ, Nagyerdei krt. 98. (Elméleti Tömb 4. em. 408.).

Rövid leírás

Mikroszkópos tomográfiára (optikai szeletelés), illetve molekuláris mobilitás és együttmozgás kimutatására alkalmas berendezés. A mikroszkóp 3 lézere 456, 470, 488, 514, 543 és 633 nm-es gerjesztési hullámhosszakat biztosít. A mintából egyidejűleg 3 fluoreszcencia – ebből 2 spektrális feloldású – és egy áteső fényű (DIC kontrasztozású) jel detektálható. Pásztázással 0,5 μm optikai szeletvastagságú képek készíthetők, melyekből rekonstruálható a minta 3D képe, a biomolekulák térbeli eloszlása, kolokalizációja. Fluoreszcencia rezonancia transzfer (FRET) mérésekkel a molekuláris kölcsönhatásokat tanulmányozhatjuk. A mikroszkóphoz egyedi tervezésű, háromcsatornás fluoreszcencia korrelációs és keresztkorrelációs spektroszkóp (FCS, FCCS) kapcsolódik, mellyel a sejt kiválasztott (0,3 μm3-es) térfogatelemében végezhető FCS mérés. A diffundáló molekuláktól származó fluoreszcencia időbeli ingadozását érzékeny lavina fotodiódákkal detektáljuk. A fluoreszcencia autokorrelációs függvényéből 10-100 pM-os érzékenységgel meghatározható a fluoreszcens molekulák lokális koncentrációja, diffúziós állandója (mobilitása) és aggregációfoka. Keresztkorrelációs mérésekkel kimutatható a megjelölt molekulák együttmozgása, a kölcsönhatások stabilitása. Vizsgálhatók pl. fehérje-fehérje, receptor-ligandum, DNS-fehérje kölcsönhatások. Az FCS detektorokkal egyedi molekula érzékenységű FRET mérés is végezhető (ALEX FRET), mellyel egyedi molekulapárok kölcsönhatása is kimutatható.

Kapcsolat

Dr. Vámosi György

E-mail:

Tel.: +36 52 412 623 (titkárság), +36 52 411 717 / 66369-es mellék (közvetlen)

 

A műszer főbb komponensei

  • Olympus IX81 teljesen motorizált inverz mikroszkóp, Prior ProScan II motorizált tárgyasztallal. A hagyományos tárgylemezeken kívül a mintatartóban petri csészék vagy sejttenyésztő kamrák is elhelyezhetők, élő sejtes minták is vizsgálhatók.
  • Olympus UPLSAPO 60X olaj és vízimmerziós objektívek. Rendkívül alacsony szférikus és kromatikus aberrációjú objektívek, melyek ideálisak konfokális és FCS mérésekhez. Áttekintő képek felvételéhez, illetve petri csészékben, 96 lyukú plate-ekben levő minták vizsgálatához nagy munkatávolságú 40x objektív.
  • Olympus Fluoview FV1000 konfokális pásztázó egység 3 szimultán fluoreszcencia detektálási csatornával. Ebből 2 spektrális, változtatható sávszélességű, így bármely fluorofór emissziójára optimálisan beállítható, illetve spektrális pásztázás révén átfedő emissziós spektrumú fluorofórok is elkülöníthetők. Transzmissziós csatorna: a transzmissziós képhez DIC (differenciális intereferencia kontraszt) üzemmód is használható.
  • Ar-ion (458; 488 és 514 nm) zöld HeNe (543 nm) és vörös HeNe (633 nm) lézer fényforrások.
  • Kétcsatornás fluoreszcencia korrelációs detektor, ALV hardver korrelátor.
  • Supertech rezgésmentes asztal a mikroszkóp elhelyezésére.
  • Nagyteljesítményű számítógép duál 20’ TFT kijelzővel, FV10-ASW v1.5 szoftver a mérések vezérlésére és adatfeldolgozásra. 3D projekciók és animációk készíthetők, spektrális dekonvolúció végezhető.
  • ·        A műszer a DE OEC Elméleti Tömb. 4. emelet 418. laborjában üzemel.

 

 A műszer elérhetősége más intézetek dolgozói és külső felhasználók számára

A műszer előzetes egyeztetés alapján a DE OEC más tanszékein dolgozó kutatók és más intézmények számára is rendelkezésre áll. Ebben a kérdésben forduljon a műszer rendszergazdájához, Dr. Vámosi Györgyhöz (tel. +36 52 411 717 / 55369,  +36 20 453 2400, email:  ). A regisztrált felhasználók internetes naptár (Google Calendar) segítségével iratkozhatnak fel.

Hozzáférés elvei

  • Mind kutatási, mind K+F célra hozzáférhető
  • Témavezetővel történő egyeztetés szükséges
  • Konfokális mikroszkópiában tapasztalattal rendelkező szakemberek rövid kiképzés után önállóan használhatják
  • Jelenleg nincs főállású személyzet. Kis volumenű munka esetén lehetőség van a KI üzemeltetésében jártas szakemberek segítségének igénybe vételére, vagy pedig hosszabb távon kollaboráció kialakítására.
  • Regisztrált, kiképzett felhasználók önállóan feliratkozhatnak internetes naptáron keresztül.
  • A hozzáférés az akadémiai szférában tevékenykedő kutatók számára jelenleg ingyenes, ezt önköltségessé kívánjuk tenni. A közeljövőben kidogozandó szabályzat tartalmazni fogja a díjszabást. Vállalatok önköltségi árat térítenek.

Egyéb információk

Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia jelentősége

Az évek során eljutottunk a sejtpopuláció, illetve sejtszintű vizsgálatoktól (fluorimetriás és áramlási citometriás energia transzfer mérés) a szubcelluláris szintű módszerekig (konfokális mikroszkópos kolokalizáció és pixelenkénti energia transzfer mérések, atomerő mikroszkópia és elektronmikroszkópia). A következő fontos lépés a néhány molekulából álló molekulakomplexek, illetve egyedi molekulák vizsgálata. Az érzékenység és felbontóképesség növelésére való törekvés nem öncélú. Egyrészt számos projektünk került abba a fázisba, hogy az igazán fontos és érdekes kérdések felvetéséhez és megválaszolásához egyedi molekulák detektálásra képes technika szükséges. Másrészt a sejtvonalakon végzett munka kiterjesztése klinikai kollaborációk keretében meghatározott betegcsoportokra szintén megnövelt érzékenységet követel meg, mivel a sejtvonalak által nagy mennyiségben termelt fehérjék (pl. interleukin receptorok) száma a humán mintákból származó sejtekben jóval alacsonyabb.

A korrelációs mikroszkópia alacsony expressziós szintű, ezért más módszerekkel nehezen vagy egyáltalán nem mérhető fehérjék élő sejtben történő in situ vizsgálatát teszi lehetővé 25 nm pontossággal kijelölt sejtbeli térfogatelemben. Segítségével meghatározható fluoreszcensen jelölt biomolekulák aggregációfoka, mobilitása, mobilis és immobilis (pl. citoszkeletonhoz rögzített) hányada, koncentráció-eloszlása és mennyisége, kimutathatók a molekulák közti kölcsönhatások élő sejtekben in situ. A technika keresztkorrelációs variánsának alkalmazásával kimutatható, ha két eltérő spektrális tulajdonságú fluorofórral jelölt molekula együtt lép be és lép ki a mérőtérfogatból. Ha ez a közös mozgás a molekulák jelentősebb hányadára jellemző, az a molekulák stabil asszociációjára utal. Megfelelő kontrollok elvégzése után az asszociált hányad is becsülhető, nemkülönben pedig az asszociátum mérete, melynek négyzetgyöke arányos a diffúziós állandóval.

 A készülék beszerzését lehetővé tevő források

Az MTA-DE Sejtbiofizikai Kutatócsoportja (MTA SBK), DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézete (DE OEC BSI), valamint a DE OEC Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézetében (DE OEC BMBI) működő Magreceptor Kutatócsoport 2004 márciusában GVOP-KMA (GVOP-2004-3.2.1) pályázatot nyújtott be “Fluoreszcencia fluktuációs mikroszkóp beszerzése” címmel (témavezető: Dr. Damjanovich Sándor akadémikus, projekt menedzser: Dr. Vámosi György). A pályázat keretében 2004 novemberében a műszer beszerzéséhez sikerült 55 500 000 Ft támogatást elnyerni. 2005 elején megkezdtük a tárgyalásokat a műszer két fő egysége, a korrelációs egység, valamint a mikroszkóp beszerzésére. Ekkorra megjelent a piacon olyan mikroszkóp, mely moduláris felépítése folytán lehetővé tette a pályázatban szereplő korrelációs mikroszkóp és egy sokoldalúan alkalmazható konfokális mikroszkóp egy készüléken belüli megvalósítását. Ennek beszerzéséhez kiegészítő forrásokra volt szükség (OTKA NK61412 sz. pályázat, témavezető: Dr. Damjanovich Sándor, OTKA T48745, témavezető: Dr. Vámosi Gy.). A pályázat önrészét a DEOEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet biztosította. A készülék beüzemelésére 2006. augusztusában került sor.

Frissítés dátuma: 2018.07.10.